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載體指南
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載體構(gòu)建質(zhì)粒DNA制備
病毒包裝服務(wù)
mRNA基因遞送解決方案
CRISPR基因編輯解決方案
shRNA基因敲低解決方案
線蟲gRNA和Cas9共表達載體
概述
CRISPR/Cas9（成簇規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列/CRISPR相關(guān)蛋白9）系統(tǒng)極大地促進了多種物種的體外和體內(nèi)基因抑制實驗。在細胞內(nèi)，Cas9核酸酶與引導(dǎo)RNA（gRNA）形成復(fù)合物，該復(fù)合物通過與基因組中的18-22 nt的同源靶序列直接相互作用提供靶向特異性。gRNA與靶位點通過互補配對使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因組中的靶位點。Cas9掃描基因組并切割與gRNA互補的序列，前提是這些序列跟隨著一段NGG前間區(qū)序列鄰近基序（PAM）。雙鏈DNA斷裂隨后被HDR或者NHEJ途徑修復(fù)，從而產(chǎn)生不同大小長度的位點突變（堿基插入或缺失）。
使用一個一體化的同時表達Cas9和gRNA的載體，或者分開表達Cas9和gRNA的載體，可以方便地在線蟲中進行CRISPR/Cas9編輯。該載體系統(tǒng)屬于前者，一個載體上同時表達gRNA和一個線蟲密碼子優(yōu)化的Cas9（CeCas9）。該載體可以被注射到線蟲的遠端性腺，然后進入生殖細胞細胞核。篩選突變后代，獲得突變可遺傳的基因敲除線蟲品系。
為了實現(xiàn)在線蟲中的高效CRISPR基因編輯，云舟生物開發(fā)了gRNA和Cas9共表達載體。該載體的gRNA在線蟲密碼子優(yōu)化的U6啟動子下驅(qū)動表達。在gRNA終止子的下游，線蟲強啟動子eft-3被用于驅(qū)動CeCas9表達，并帶有一個包含polyA加尾信號序列的3’ UTR。
關(guān)于該載體系統(tǒng)的更新信息，請參考以下文獻。
| 參考文獻 | 主題 |
|---|---|
| Genetics. 202:885 (2016) | DNA transformation in C. elegans |
| Curr Protoc Mol Biol. 129 (2019) | CRISPR/Cas9 vectors in C. elegans |
| Nat Methods. 10:741 (2013) | gRNA design for C. elegans |
亮點
我們的載體系統(tǒng)已經(jīng)過優(yōu)化，其在大腸桿菌中具有高拷貝復(fù)制能力，且對細胞具有高效轉(zhuǎn)染率。該載體可以在線蟲中有效地通過同時表達gRNA和Cas9實現(xiàn)基因編輯。
優(yōu)勢
技術(shù)簡單：使用顯微注射即可把質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞，相比起病毒載體需要進行病毒包裝，過程更簡單。.
突變可遺傳：通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)在生殖細胞進行基因編輯，可以獲得穩(wěn)定的突變可遺傳的線蟲品系。
不足之處
基因拷貝數(shù)在不同細胞中呈現(xiàn)差異性：盡管成功的轉(zhuǎn)染可以在單個細胞里產(chǎn)生非常高的拷貝數(shù)，但不同細胞間卻有高度的差異性。在一些細胞中，質(zhì)?？截悢?shù)非常高，而在另外一些細胞卻是低拷貝甚至沒有。
PAM要求：CRISPR/Cas9靶位點必須包含NGG序列（使用較多），也叫做PAM序列，位于gRNA識別序列3'末端。
關(guān)鍵元件
CeU6: C. elegans U6 small nuclear RNA promoter. It drives strong expression levels of small RNAs.
gRNA: Guide RNA compatible with the Cas9 variant being used.
Terminator: Pol lll transcription terminator. It allows transcription termination of small RNA transcribed by Pol lll RNA polymerase.
eft-3: C. elegans ef1ɑ promoter. It drives strong expression levels in somatic cells.
Kozak: AKozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest to facilitate translation initiation in eukaryotes.
CeCas9: CRISPR-associated endonuclease that cuts DNA at a location specified by gRNA. This S. pyogenes Cas9 is codon-optimized for C. elegans and contains multiple synthetic introns, a carboxy terminal nuclear localization signal, and an HA tag.
unc-54 3’ UTR+polyA: Myosin-4 3’ UTR with downstream polyA from C. elegans. It allows transcription termination and polyadenylation of mRNA transcribed by Pol II RNA polymerase.
Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.
pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.
